黑果花楸果实中花青素含量分布及抗氧化活性

贾秀娟，魏晓瑶，赵艳敏，刘岱琳，石浩源，齐书艺

(1．天津中医药大学，天津 300193；2．中国人民武装警察部队后勤学院，天津 300162)

摘 要 ：研究黑果花楸的新鲜果 实、果梗榨 汁前后花青素含量的分布 ，并比较其抗氧化活性。以矢车菊素一3—0一葡萄糖苷(C3G)为标 准品 ，利用紫外分光光度 法测定榨 汁前后黑果花楸果实中花青素含量的分布；并利用 清除 DPPH 自由基的方法测定不 同部位的抗氧化 活性 。试验结果显 示花青素的标准 曲线方程 为 y=22．381x+0．0126，R=O．9998，样品在9．9~mL~26．4g／mL范围 内线性关 系良好 ，回收率为 97．96％～100．77％。去除果 实中水分对其含量的影响 ，黑果花楸新鲜果 实、果梗 、榨汁后果 实、果梗 中花青素含 量分别为 23．31、0．96、5．08、0．58mg／g。其 Ec 值 分别为 91.16、916.6、126．6、607．3t~gCmL。花青素含量分布的变化及其抗氧化活性分析结果显示，黑果花楸汁后的果渣是一种具有很好抗氧化活性且花青素含量丰富的功能食品开发原料 ，为其后续开发奠定基础。

关键词：黑果花楸；花青素；含量；抗氧化；果实；果梗

黑果花楸 (Aroniamelanocarpa)~名野樱莓，不老莓，原产于美国东北部，属蔷薇科腺肋花楸属的一个种,落叶灌木，具有较强的耐寒能力，可耐一4O℃低温，是美国特有的集食用、药用、园林和生态等价值于一身的珍贵树种。营养学研究发现黑果花楸果实具有潜在的保肝、保护心脏、降血糖和抗突变等作用，在欧美国家主要用于预防高血压、心脑血管疾病的功能食品原料的开发 ，且已有其保健型果汁饮料、果茶、果酱、保健胶囊、片剂等产品的销售。我国最早是在上世纪九十年代开始进行黑果花楸的引种工作，2001年辽宁省干旱地区造林研究所依托国家干旱项目资助，经过一系列的育种栽培优化，成功实现了黑果花楸的引种育种。现在黑果花楸在我国的种植面积连年增加，但该果实资源在我国的综合开发利用尚处于起步阶段，目前没有相应的深加工产品，如保健功能食品、药用功能食品等。黑果花楸中的主要功效成分为花青素及其酚酸类成分，具有较强的抗氧化性。近年来国内学者开始关注黑果花楸果实中花青素和多酚等活性成分的提取工艺和相应功效研究。黑果花楸是高附加值的果实，其新鲜果实多用于进行榨汁，而其果渣则有望成为深加工原料，对其深加工研究刚刚起步。本文以矢车菊素为对照品，利用紫外分光光度法建立花青素的含量测定方法，考察了黑果花楸果实榨汁前后花青素的分布情况，并利用清除DPPH自由基活性的方法比较了不同部位的抗氧化活性。研究结果为综合评价黑果花楸果渣的精深加工奠定基础，将促进该果实资源的综合开发利用，提高产品附加值。

1材料与方法

1.1主要材料

黑果花楸由辽宁富康源黑果花楸科技开发有限公司提供样品，挑选出无病虫害和机械损伤且成熟度一致的黑果花楸果实，清洗沥干后速冻，并于-80℃超低温冰箱中冻藏；黑果花楸果梗也由辽宁富康源黑果花楸科技开发有限公司在采摘果实时提供的果梗样品。矢车菊素一3一O一葡萄糖苷(C3G)：天津市科曼思特医药科技发展有限公司提供(含量95％)；二苯代苦昧酰肼(DPPH)：上海思域化工科技有限公司；维生素c(V)：天津市福晨化学试剂厂；甲醇(分析纯)：天津市康科德科技有限公司 ；浓盐 酸(分析纯 )：天津市化学试剂五厂 ；娃哈哈纯净 水。

1．2 仪器设备

KQ一500型超声波清洗器 ：昆山市超声仪器有限公司 ；UV一1800紫外分光光度计 ：日本岛津公司 ；AL204电子天平 ：梅特勒一托利多仪器 (上海)有限公司 ；DGG一9140型电热恒温鼓风干燥箱 ：上海森信实验仪器有限公 司 ；Sunrise多功能酶标仪 ：瑞士 TECAN公司 ；96孔酶标板 。

l.3 方法

1．3．1 C3G标准品储备液的配制方法精密称定矢车菊素标准品 1．65mg，置于25mL棕色容量瓶中,用 1％(体积分数)盐酸水溶液溶解并定容至刻度，配置成浓度为 0.066mg／mL的C3G标准品储备液置于4℃中保存备用 。

1．3．2 样 品测定

溶液的配制准确称取黑果花楸新鲜果实、果梗,以及榨汁后的果实 、果梗各2g，置于50mL锥形瓶中,加入 1％(体积分数)盐酸水溶液20mL，超声提取两次 ，每次30min，滤过，合并提取液 ，转移至50mL容量瓶中并定容至刻度待用 。

1．3．3 方法学考察

1．3．3．1 标准曲线的制作

分别精密量取 “1．3．1”项下标准品溶液 1．5、2．0、2．5、3．0、3．5、4.0mL，置于10mL容量瓶中，用 1％(体积分数)盐酸水溶液定容至刻度，摇匀，于 540nm处测定其吸光度 。以吸光度Y对花青素的质量浓度 x(mg／mL)测定线性回归方程 。

1．3．3．2 精密度试验

分别精密量取“1．3．1”项下标准品溶液 2mL至10mL容量瓶中，用 1％(体积分数)盐酸水溶液定容至刻度 ，摇匀 ，在 540nm处平行测定 A值 6次 ，计算 RSD。

1.3．3．3 稳定性试验

分别量取黑果花楸新鲜果实、果梗，以及榨汁后的果渣 、果梗的供试品溶液，分别于 0、2、4、6、8、10、12h测定其A值，计算 RSD。

1．3．3．4 重复性试验

精密称取黑果花楸果梗原料5份 ，按 “1．3．2”项下方法制备供试品溶液 ，在 540lqm下平行测定其 A值 ，计算 RSD。

1．3．3．5 加样回收率试验

以黑果花楸果梗为例进行加样回收率试验，精密称取已知总花青 素含量 的黑果花楸 果梗 0．5g，分别加入相当于样品中总花青素含量 的 80％、100％、120％的对照品，按 “1．3．2”项下方法配置待测溶液 ，在 540nm处测定其A值，计算加样回收率 。每组试验平行进行3次 。

1．3．4 样品的前处理

方法优化1．3．4．1 提取方法考察精确称取黑果花楸榨汁后的果渣2份，每份2g，分别置于 50mL容量瓶 中，加入40mL1％(体积分数)盐酸水溶液，采用超声提取、室温浸提两种方法各提取30rain，待提取液放置于室温 ，用 1％(体积分数 )盐酸水溶液定容至刻度，摇匀 ，过滤后得到续滤液 ，测定其吸光度值，计算花青素含量。每组试验平行进行3次，根据试验结果比较两种提取方法的提取效果 。

1．3．4．2 提取溶剂考察

精确称取黑果花楸榨汁后的果渣3份 ，每份2g，分别置于50mL锥形瓶中，由于花青素在酸性溶液中溶解度较大 ，故选择酸性溶剂为提取溶剂 ，分别用含有体积分数为 1％盐酸的纯净水 、60％甲醇溶液及60％乙醇溶液各40mL超声提取 ，待超声提取液放置于室温后 ，用相对应的溶剂定容至刻度 ，摇匀 ，过滤 ，测定滤液的吸光度，计算其花青素含量 。每组试验平行进行3次 。根据试验结果，比较不同提取溶剂的提取效果。

1．3．4.3 提取次数考察

精密称取黑果花楸榨汁后的果渣3份各1g，分别用20mL体积分数为1％盐酸水溶液进行超声提取，提取次数分别为1、2、3次，合并提取液，转移至100mL容量瓶中，定容至刻度，测定其吸光度，计算花青素含量。根据试验结果，比较不同提取次数的提取效果。

1．3．5水分测定

参照2015版药典中水分测定法测定黑果花楸不同样品的水分含量。精密称取每种样品各3份，每份5g，平铺于事先已经干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过5mm，疏松供试品不超过10mm，精密称定，开启瓶盖在 100℃～105℃干燥5h，将瓶盖盖好，移置干燥器中，放冷30min，精密称定，再在上述温度干燥1h，放冷，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算供试品中含水量

1．3．6样品中花青素的含量测定

按照“1．3．4”项下确定的最佳样品处理方法获得各种黑果花楸原料的提取液，并分别精密量取各样品溶液1mL，置于10mL容量瓶中，加人体积分数为 1％盐酸水溶液定容至刻度，摇匀，在540nm处测定吸光度，计算花青素的含量。

1．3．7抗氧化活性的测定

1．3．7．1制备DPPH溶液

精确称取DPPH粉末2．15mg，置于50mL棕色容量瓶中，加人甲醇超声溶解，并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为43．0p~g／mL的溶液，于4cc冰箱中冷藏备用。

1.3．7．2 对照品溶液制备

精确称取V粉末适量，置于25mL棕色容量瓶中，加入甲醇超声溶解，并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为406．4~g／mL的对照品贮备溶液，置于4℃冰箱中备用。精密量取贮备液1mL，置于25mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，获得测试用溶液，然后通过倍半稀释，配成不同浓度的测试溶液。

1．3．7．3待测样品溶液的制备分别量取“1．3．2”项下各样品溶液适量，置于25mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。然后通过倍半稀释，配成不同浓度的样品测试溶液，用于测定抗氧化活性。

1．3．7．4测定方法分别移取100IxL不同浓度的v 液置于每孔含有100LDPPH溶液的96孑L酶标板中，混匀 ，室温反应30min后，利用酶标仪在517nm处测定吸光度记为A；使用100ILL甲醇代替V溶液，同法操作，测定其吸光度记为A；使用100L甲醇代替DPPH溶液，分别加入100ILL不同浓度V溶液，同法操作，测定其吸光度记为A 。按照以下公式计算V对DPPH自由基的清除率(％)。清除率／％= b一(A-A )] b~100同法测定和计算黑果花楸各部位对DPPH自由基的清除率(％)，将待测部位的清除自由基能力进行比较。清除率越大抗氧化能力越强。每个样品设5个浓度组，每个试验组设置3个孔，重复试验两次 。

1．3．7．5 半数清除浓度的确定

半数清除浓度是自由基清除率达到50％时的浓度，以EC∞表示，常用来比较清除DPPH自由基的能力大小，EC蜘值越小，表明其清除自由基的能力越强。以样品的浓度(~g／mL)为横坐标，样品对DPPH自由基的清除率(％)为纵坐标绘制量效曲线，由曲线得到各样品的EC∞(p~g／mL)值。

2结果与讨论

2．1含量测定

2．1．1方法学考察结果按 “1.3．3”项下方法进行方法学考察，结果显示花青素在9．9~g／mL-26．4p~g／mL范围内与吸光度呈现良好的线性关系，回归方程为 y=22．381x+0．0126，R=0．9998。精密度试验结果显示6次测量值的RSD=0．36％，表明在该条件下仪器精密度良好。稳定性试验测定结果显示黑果花楸各部位样品溶液在12h内稳定,其RSD值分别为1．1％、1．3％、1．6％、1．8％。重复性试验测定结果显示该方法重珊I生良好，其RSD值为0．59％。选取黑果花楸果梗进行的加样回收率试验，每组试验平行测定3次，其结果如表1所示，显示回收率为97．96％～100．77％，符合方法学的要求 。

考察对花青素的提取效果，两种提取方法获得样品的花青素含量平均值分别为5．482、3．362mg／g。由此试验结果可以确定超声提取的效果最佳。因此，以超声提取的方法作为黑果花楸中花青素的提取方法。

2．1．2．2提取溶剂

通过提取溶剂的考察，选取含有体积分数为1％盐酸的水、60％甲醇及60％乙醇3种不同溶剂对黑果花楸榨汁后的果渣中花青素进行提取，其获取的样品中的花青素分别为5．482、3．646、2．799mg／g。通过单 因素考察确定提取溶剂为1％盐酸水溶液的提取效果最佳。因此，以1％(体积分数)盐酸水溶液作为检测黑果花楸样品中花青素含量的提取溶剂。

2．1．2．3提取次数选取同一批次的黑果花楸果渣分别利用超声提取的方法提取1、2、3次，通过对提取液中花青素的含量测定，结果显示提取1次、2次和3次的含量分别为4．532、4．537、4．541mg／g。结果显示样品提取1次、2次和3次之后花青素的含量变化不大，说明按照20倍量的溶剂进行提取，提取1次就可以达到提取完全的效果，因此后续样品中花青素的含量测定结果就选取提取1次进行检测。

2．1.3水分测定结果

黑果花楸是果实类原料，水分含量非常丰富。研究其中的花青素含量，就要考虑到水分的影响，只有排除水分的影响，才能全面地比较样品中花青素的含量。因此根据药典规定的方法测定各部位样品中的水分含量，结果见表2。通过水分测定结果，可以确定榨汁后果实和果梗中的含水量较为接近，并且该结果为后续确定黑果花楸中各部位样品中花青素的绝对含量奠定基础。

2．1．4黑果花楸中花青素的含量测定

按“1．3．6”项下方法测定黑果花楸各部位样品的花青素含量，其结果如表3所示 。

根据各部位样品的水分含量，消除水分对样品花青素测定干扰，从而计算分析纯干品黑果花楸的各部位样品中花青素的含量，更为有利于分析比较。通过测定结果，可以发现去除水分影响后，果实中的花青素含量最高，榨汁后的果渣中仍含有大量花青素，约有21．8％的花青素存留在果渣中，说明榨汁后的果渣仍具有较高的利用价值。

2．2抗氧化活性

2．2．1各部位对DPPH自由基的清除率取“1．3．7．3”项下样品溶液，测定其对DPPH自由基的清除率，结果如表4所示。

2．2．2黑果花楸各部位样品浓度对DPPH自由基清除率黑果花楸各部位样品浓度对DPPH自由基清除率曲线见 图 1。

2．2.3 各部位样品的半数清除浓度

经过分析黑果花楸各部位样品不同浓度一对DPPH自由基清除率曲线，得到各部位样品对DPPH自由基的半数清除浓度Ec卯(Ixg／mL)，Ec卯值越小，证明其抗氧化活性越强。试验结果如表 5所示 。

果实的抗氧化活性要远高于果梗，消除水分的影响后，我们发现果渣清除DPPH自由基的EC卯与果实的EC非常接近 ，说明即便新鲜的黑果花楸经过榨汁后，花青素的含量随着果汁的分离而降低了很多，但是其清除DPPH自由基的抗氧化作用强度却下降不多，这说明榨汁后的果渣仍是具有较强抗氧化活性的原料，具有进一步的开发潜力和未来的应用价值。

3结论

黑果花楸是一种药食同源的材料，对心脏病、高血压等心血管疾病具有特殊疗效，目前已经受到国内外学者的广泛关注。但是鲜果难以保存，一般采摘后会通过榨汁，实现果渣和果汁分离，利于原料的贮存和利用。黑果花楸果汁可用于加工果酒、果酱等食品，但是榨汁后的果渣尚未被开发利用。本文利用紫外分光光度法测定榨汁前后黑果花楸果实中花青素含量的分布；并利用清除DPPH自由基的方法测定不同部位的抗氧化活性，从而综合分析评黑果花楸不同部位，尤其是其果渣的开发利用价值。本文采用紫外分光光度法测定花青素含量，方法简单、快速，重现性好。花青素对温度、光线等较敏感，因此反应在室温下进行。在制备样品的提取方法优化过程中发现，使用体积比为1％盐酸水溶液，按照1：20(g／mL)的物料 比超声提取1次，时间为30min可以较为有效地将黑果花楸中花青素提取完全，从而确定了本研究中黑果花楸样品检测的前处理提取方法。本文对黑果花楸果实不同部位及其榨汁前后花青素的含量进行研究，结果显示黑果花楸中花青素的含量依次为榨汁后的果实>新鲜果实>新鲜果梗>榨汁后的果梗，去除水分对其含量的影响，花青素含量为新鲜果实>果渣。此外 ，通过测定各部位样品对DPPH自由基的清除能力 ，评估其抗氧化活性，结果显示果实的抗氧化作用远优于果梗，而且新鲜果实的抗氧化作用与榨汁后的果渣作用相近。综合分析说明果渣中仍含有大量的花青素，且具有较强的抗氧化活性，是一种非常有价值的有待于开发的抗氧化产品的原料。因此可以选择合适的方法对其进行深加工，使黑果花楸的药用价值得到充分发挥。本试验成功验证了榨汁前后黑果花楸中花青素的含量变化，并比较了榨汁前后的抗氧化活性，为今后黑果花楸果渣的进一步开发利用提供可靠依据，促进该果实的综合开发利用。